プロスタノイド受容体の病態での役割解析と薬物制御の研究
HOME > 研究内容 ( プロスタノイド受容体の病態での役割解析と薬物制御の研究 )

Overview

皆さんが、風邪を引くと、熱が出て、食欲がなくなり、体の節々が痛くなります。この時に風邪薬を服用すると、熱が下がり、体が軽くなったような気がして、食事をしようかという気になります。また、虫歯で歯が痛み腫れているときに、歯医者さんでもらった頓服薬を飲むと、腫れがひき、痛みが軽減します。このような作用がおこるのは、これらの薬にアスピリンやインドメタシンなど非ステロイド性抗炎症薬と呼ばれる薬物が入っているからです。非ステロイド性抗炎症薬は、生体内で様々な刺激に応じて産生されるプロスタノイドの生合成を抑制して、解熱、鎮痛、抗炎症などの作用を発揮します。

プロスタノイドとは脂肪酸であるアラキドン酸に由来する一群の生理活性物質で、プロスタグランジン(PG)D2, PGE2, PGI2, PGF, やトロンボキサン(Tx)A2などがあります。図1に、プロスタノイドの生合成経路を示しました。プロスタノイド産生は、まず、アラキドン酸が細胞膜リン脂質からホスホリパーゼA2によって切り出され、ついで、アラキドン酸がシクロオキシゲナーゼ(COX)によりPGH2に変換され、このPGH2が特異的な合成酵素によって各々のプロスタノイドに変換されることによって行われます。この経路はアラキドン酸が順に代謝されていく経路であるため、アラキドン酸カスケードと呼ばれています。非ステロイド系抗炎症薬は、初発酵素であるシクロオキシゲナーゼ (COX) を阻害し、すべてのプロスタノイドの生成を抑制して、作用を発揮します。

プロスタノイドの生合成経路
図1: プロスタノイドの生合成経路
アラキドン酸から出発して、各プロスタノイドに至る経路を示す。

では、プロスタノイドはどのようにして効果を発揮するのでしょうか?
従来の平滑筋などを用いた古典的な薬理学実験から、各プロスタノイドに対応して受容体が存在することが示唆されていました。

私たちのグループはプロスタノイド受容体として初めてトロンボキサン受容体(TP)をヒト血小板より精製し、cDNAのクローニングに成功しました。ついで、TP受容体の配列をもとに、スクリーニングを行い、これまでに8種類あるプロスタノイド受容体 (DP, EP1, EP2, EP3, EP4, IP, FP, TP) のクローン化に成功しました。これにより、PGD2, PGI2, PGF, TxA2 に対応してそれぞれ1種の受容体、DP, FP, IP, TPがあること、PGE2には、EP1〜EP4の遺伝子の異なる4種の受容体が存在することが明らかとなりました。これらの受容体は、すべて、細胞膜を7回貫通するG蛋白質連関型受容体で(図2)、細胞内情報伝達によって3つのグループに分けられます(図3)。また、図4に示すように、それぞれの受容体は生体における発現部位が各々異なっています。すなはち、プロスタノイドの生体内での役割の多様性は、受容体の種類の多様性、それぞれのシグナル伝達の多様性、発現分布の多様性によって担われているものと思われます。
その後、PGD2には、もう一つ別の受容体CRTH2が存在することが報告されました。)

ヒト・トロンボキサン受容体の細胞膜トポロジーモデル
図2: ヒト・トロンボキサン受容体の細胞膜トポロジーモデル
細胞内情報伝達によりプロスタノイド受容体のグループ分け
図3: 細胞内情報伝達によりプロスタノイド受容体のグループ分け
マウス各臓器でのプロスタノイド受容体の発現と腎でのEP1 およびEP3受容体の発現分布

図4A: (左)マウス各臓器でのプロスタノイド受容体の発現(northern blot analysis)
図4B: (右)腎でのEP1 およびEP3受容体の発現分布(in situ hybridization)

それでは、アスピリンで抑制される様々な病的症状は、それぞれどの受容体がどのように働いて発現しているのでしょうか?プロスタノイドの作用は、薬物の制御の対象になる“悪い“作用だけでしょうか?病態でなく、生理状態でのプロスタノイドの役割はどの程度重要でしょうか?さらに、アスピリンの作用から考えられることが、生体でのプロスタノイドの働きの全てでしょうか?さらに、受容体の知見をもとに、より良い治療薬を開発できないでしょうか?

我々は、これらの疑問に答えるため、8種類の受容体の各々の遺伝子欠損マウスを作製し、これらを様々な病態モデルに供することにより、個体の生理と病態生理におけるプロスタノイドの役割を解析してきました。また、製薬会社と共同して、各々の受容体に選択的に働く薬物の開発を促してきました。これら遺伝子欠損マウスの解析と受容体タイプ選択的作用薬の実験により、まず、アスピリンが抑制する様々な病的症状が、どの受容体がどのように働いて発現しているのかが明らかになってきました。これには、例えば、LPSやサイトカインによる発熱においてPGE2-EP3受容体経路が必須の役割を果たしていること、また、妊娠末期の黄体で、PGF-FP受容体経路が活性化され、これが黄体退縮をおこして、陣痛発来のスイッチとして働くこと、さらに、急性炎症でPGI2-IP受容体経路が腫脹や疼痛を引き起こしていることがあります。さらに、IP欠損マウスとTP欠損マウスの各々をApoE欠損マウスと掛け合わせることにより、PGI2が動脈硬化の発症・進展に抑制的にTXA2が促進的に働いていることも明らかになりました(2004年のWhat’s new”動脈硬化におけるプロスタノイドの機能解明”を参照して下さい)。また、応用面では、PGE2による骨増生をEP4受容体が介達すること、EP4アゴニストが骨粗鬆症など骨喪失の治療薬として有望であること、などを示してきました(図5)。

卵巣摘除ラットの骨喪失に対するEP4アゴニストの治療効果
図5: 卵巣摘除ラットの骨喪失に対するEP4アゴニストの治療効果
左は正常コントロール動物、真ん中は卵巣摘除動物、右はEP4アゴニストを投与した卵巣摘除動物、の大腿骨の断層イメージを示す。

私達の研究は、このように、アスピリン様薬物の作用から想定されていたプロスタノイドの様々な作用を分子レベルで解明するのに役立ってきましたが、一方、研究を進めるにつれ、アスピリン様薬物の作用からは想定されていなかった様々な作用がプロスタノイドにあることが分かってきました。これらこれまで未知であったプロスタノイド作用には、免疫やアレルギーでの働きや中枢神経系での働きが多々あります。そこで、私達は、現在、これら2つの分野に焦点をあて研究を展開しています。これらの研究の背景と現在のプロジェクトにつき以下に述べます。

 

現在の研究プロジェクト

1) 免疫・アレルギーにおける役割と薬物制御

Overviewで述べたように、非ステロイド性抗炎症薬には消炎効果があり、またPGE2やPGI2を皮膚などに外因的に塗布すると発赤・腫脹などの炎症の主徴を示します。これらのことから、従来プロスタノイドは炎症反応(特に急性炎症反応)を促進する物質と考えられてきました。一方、花粉症、喘息、アトピーなどのアレルギーや免疫疾患では非ステロイド性抗炎症薬による症状の軽減がほとんど認められないことから、アレルギーや免疫反応にはプロスタノイドの関与は少ないものと考えられてきました。

ところが、受容体欠損マウスや選択的作用薬を用いた私達の研究から、プロスタノイドが、免疫・アレルギーの様々なレベルで働いていることが明らかになってきました。例えば、マウスの腹部にハプテンを塗り、1週間後に同じハプテンを耳に塗布すると、このハプテンに対する免疫炎症が起こり耳は腫脹します。この接触性皮膚炎モデルで、TxA受容体(TP)欠損マウスでは炎症の促進が認められるのに対し(図6)、PGE受容体EP4サブタイプ欠損マウスでは逆に炎症の抑制が認められます(図7)。接触性皮膚炎は、抗原感作による免疫の成立と感作抗原による炎症誘発の2つの相よりなります。これまでの常識から、プロスタノイドは、炎症誘発相で働くものと想定しましたが、驚いたことに、それぞれの受容体に対する選択的阻害薬を用いた実験から、TP経路もEP4経路もともに免疫成立に働いていることが明らかになりました。詳細な解析から、PGE2-EP4経路は、抗原を取り込んだLangerhans細胞が皮膚から所属リンパ節に遊走し成熟する過程を調節していること、TXA2-TP経路は、リンパ節に到達したLangerhans細胞とナイーブT細胞の接触を調節して成立免疫の強度を決めていることが明らかになりました(図8)。即ち、プロスタノイドは、その種類によって、免疫成立の異なった過程に、場合によっては拮抗するように、働いていることが明らかになったのです。アスピリンなどの抗炎症薬が通常免疫に効果が無いのは、このようなプロスタノイドの働きを全て抑えているからと思われます。

耳介の組織切片-トロンボキサン受容体(TP)欠損マウス-
図6:
トロンボキサン受容体(TP)欠損マウスは接触性皮膚炎モデルで炎症反応の増強を示す。図は耳介の組織切片。炎症細胞の浸潤により耳介が腫れている。
   
耳介の組織切片-プロスタグランジンE受容体EP4サブタイプ欠損マウス-
図7:
PGE受容体EP4サブタイプ欠損マウスでは接触性皮膚炎モデルにおいて反応の抑制が認められる。
   
接触性皮膚炎の成立過程とそこにおけるPGE2-EP4経路、TXA2-TP経路の各々の作用点
図8:
接触性皮膚炎の成立過程とそこにおけるPGE2-EP4経路、TXA2-TP経路の各々の作用点を示す。

上では、プロスタノイドが種によって免疫成立という一連の過程で拮抗的に働いていることを述べましたが、私達は、異なったプロスタノイド間での拮抗をアレルギーでも見いだしています。

私達が、アレルギー炎症のモデルとして用いているのは、卵白アルブミンによる気管支喘息です。このモデルではPGD受容体(DP)欠損マウスで症状の抑制が、PGE受容体EP3サブタイプ欠損マウスで症状の亢進が認められます(図9、10)。解析の結果、DP受容体もEP3受容体も気道上皮に発現していること、PGE2は気道上皮のEP3受容体に働き、ここにおけるケモカインやその他の炎症・気道リモデリング関連遺伝子のmRNAレベルを低下させ、アレルギー炎症の進展を抑制することが明らかになりました。興味深いのは、EP3作用薬の投与は、アレルゲン暴露の3時間後であっても炎症を軽減することで、私達は、これはEP3作用薬のアレルギー治療薬としての可能性を示すものと考えています。

気管肺胞洗浄液中の浸潤炎症細胞数
図9:
PGD受容体(DP)欠損マウスではアレルギー性喘息モデルにおいて症状の抑制が認められる。
左図は気管肺胞洗浄液中の浸潤炎症細胞数を示している。
右図はDP受容体が抗原吸入刺激により気道・肺胞上皮に発現誘導がかかることを示している。
図10:
EP3欠損マウスではアレルギー性喘息モデルにおいて症状の亢進が認められる。
左図は気管肺胞洗浄液中の浸潤炎症細胞数を示している。
右図は野生型およびEP3欠損マウスの肺組織像。

現在、このプロジェクトでは、上記の結果を受け、以下のような研究が進行中です。

1) リンパ球機能におけるプロスタノイドの役割解明

接触性皮膚炎モデルの結果は、プロスタノイドが直接リンパ球などの免疫担当細胞に働いてその機能を変化させることを示しています。私達は、これらはほんの一部であり、未だ未だ、様々な作用が発見できるものと考えています。現在は、ナイーブTリンパ球のTH1, TH2, TH17やregulatory T細胞への分化や分化したあとの機能発現に、プロスタノイドが関与していないか、検討しています。また、B cell 機能(とくに、class switching )へのプロスタノイドの関与も検討課題の一つです。これらを、in vitroの培養系とともに、様々なin vivo モデルで検討しています。

2) アレルギー炎症におけるEP3アゴニストの有用性の検討

卵白アルブミンによる気管支喘息で、EP3が上皮における遺伝子発現を調節してアレルギー炎症の抑制を行うという所見を上述しましたが、EP3が、気管支喘息のみでなく、その他のアレルギー疾患でも同様の作用を発揮していないかも、焦点の一つです。現在、アレルギー皮膚炎やアレルギー性結膜炎モデルを用いてこの点を検討しています。とくに、皮膚では、最近、keratinocytesそのものが炎症細胞として位置づけられており、私達が気管上皮で見いだした、EP3と上皮の関係が、皮膚でもみられるかに興味を持っています。

3) 上皮、リンパ球におけるGPCRの探索と機能解明

私達の結果は、プロスタノイド受容体というG蛋白質連関型受容体 (GPCR)が、免疫やアレルギーの調節に働いていること、その作用部位がリンパ球などの免疫担当細胞や粘膜や皮膚上皮であることを明らかにしてきました。このことを敷衍すると、プロスタノイド受容体以外のGPCRであっても、上皮や免疫担当細胞に発現していれば、何らかの機能を発揮する筈です。また、それらに対する作用薬は、アレルギー・免疫調節作用を示す筈です。私達は、この考えに立って、これら細胞・組織で系統的なGPCRの解析を行い機能を明らかにしていきたいと考えています。これまで、免疫系では、サイトカイン受容体に対して、GPCRは二義的な意味しか無いと考えられてきましたが、この研究により、新しい免疫生物学が展望できると、同時に、サイトカインに対するものとは異なった免疫調節薬の途が拓けるかもしれません。

4) アレルギーの systems biology

私達は、これまで、遺伝子欠損マウスをアレルギー病態モデルに供することにより、各病態の成立と進展に各々のプロスタノイド受容体経路がどのように働くかを解析してきました。その解析は、組織学的解析とともに、microarrayを用いた遺伝子発現の解析も含みます。これにより、一つの経路の欠如が、病態の成立にどう影響するかも明らかになっています。私達は、このアプローチを発展させ、時系列で、遺伝子発現と組織変化を追うことでアレルギー成立のメカニズムをモデル化できないかと考えています。また、ここに様々なノックアウトマウスのデータを入れ込むことにより、経路間の因果関係とその役割もインプットでき、選択的制御の病態に対する効果を予測できないかと考えています。手始めに、接触性皮膚炎の症状発現過程を対象に選び、遺伝子変化の時系列とこれに対するEP3アゴニスト投与の効果の検討を始めたところです。Systems biologyには様々なレベルのものがありますが、あまりに精緻にすぎて実用化できないようです、そこで、ここでは、皮膚という組織とそこでの各種細胞の出入り、それによる組織変化のアウトカムを主体にモデル化を考える積りです。これは、生理学教室の松岡達助手との共同研究です。

5) その他の病気モデルでの解析

これまでと異なった病態でのプロスタノイドの役割を探るため、多発性硬化症のモデルと考えられているExperimental Autoimmune Encephalitis (EAE) や肺繊維症のモデルと考えられているブレオマイシン誘発肺繊維症を用いて、それぞれの病態の形成や制御に関係するプロスタノイド受容体の同定とその働きの解明を行っています。前者からは、Th17やTregなどと関係が、後者からは、TGFβとの関係が明らかにならないかと考えています。、多発性硬化症も肺繊維症も、いずれも、治療手段のない難病とされているもので、私達の研究から何らかの治療のヒントが得られないものかと思っています。

2) 脳神経系におけるプロスタノイドの働き

Overviewに記述しましたが、プロスタノイドの作用がアスピリン様薬物で阻害されるものとして考えられてきたことから、プロスタノイドの神経系での主な働きとして、これら薬物で抑制される炎症時の痛み伝達や発熱が考えられてきました。発熱は、感染など身体侵襲に伴う全身的なストレス反応の一つと考えられていますが、これを含むsickness behaviorと総称されているものには、他に、ACTH放出や行動抑制、食欲不振などがあります。これらは、アスピリン様薬物で軽減されることからプロスタノイドが伝達しているものと想定されてきました。実際に受容体欠損マウスを使った実験から、疾病時の発熱(図11)にPGE受容体EP3サブタイプが関与することが明らかになりましたし、ACTH放出の内分泌ストレス反応には、EP3とEP1の両受容体が協調して働くことが明らかになってきています(図12)。

疾病ストレスによる発熱反応には、PGE2受容体EP3が特異的に関与する。
図11:
疾病ストレスによる発熱反応には、PGE2受容体EP3が特異的に関与する。
   
疾病ストレスによるACTH分泌にはPGE2受容体EP1・EP3が特異的に関与する。
図12:
疾病ストレスによるACTH分泌にはPGE2受容体EP1・EP3が特異的に関与する。

これらの例で見られるように、プロスタノイドはストレス反応の発現に働いています。ストレス反応は、様々な内的・外的刺激により身体の恒常性の破綻した状態と規定できます。我々人間は、実際数多くのストレス刺激の中で生活しています。かつて医療が未発達であったころは、我々の生活は上で述べた感染の危険に常に脅かされていました。医療の進歩により感染が激減した現在では、過度の労働や厳しい社会状況が心理的ストレスを与えます。面白いのは、疾病(風邪)や怪我などの身体的要因によっても、寒冷や痛みのような知覚的刺激によっても、また過度の労働や対人関係のもつれ・将来の不安といった心理的なストレスによっても、体内に共通の反応が誘導されることです。これには上で述べた神経内分泌反応などの身体的反応の他「不安」や「恐怖」といった精神反応があります。

興味深いことに、受容体欠損マウスを用いた実験からプロスタノイドが心理的ストレスによる精神反応の発現にも関与していることが明らかになってきました。それが、2005年のWhat’s newに記載した“EP1による衝動行動の制御”です。この研究では、脳内のEP1受容体がドパミンのアウトプットを制御することにより、高所などの環境ストレスや他個体との接触などの社会ストレス下での衝動行動を制御していることを明らかにしています。例えば、EP1欠損マウスでは、社会ストレスにより衝動的な攻撃性が誘発されることが見られていますし(What’s new参照)、2匹のオスマウスを同一のケージにいれて、低周波の通電によるファイティングをみる電気ショック誘発ファイティング実験では、EP1欠損マウスは、ファイティング開始までの潜時が有意に短縮されること、これは、ドパミン受容体遮断薬で抑制できること、反対にEP1作動薬は、野生型のファイティングまでの潜時を延長させることが明らかとなっています(図13)。

図13:
(左)EP1欠損マウスにおけるファイティング開始までの潜時の短縮、及び、そのドパミン受容体遮断薬SCH23390による抑制。
(右)野生型マウスにおける、EP1作動薬によるファイティング開始までの潜時延長。

これらの結果を受け、本プロジェクトでは、現在、以下のような研究を展開しています。

1) EP1によるドパミン神経系制御メカニズムの解明

EP1欠損マウスの表現型は、ドパミンのoutputが増加して衝動行動が発現される一方でhyperlocomotion が見られないことです。このため、この研究では、どうしてドパミンのoutputが増加するのかを、ドパミン神経の起始部である黒質でのEP1受容体の局在と機能を解析することにより明らかにしようとしています。また、ドパミンが運動を制御する場である線条体でのEP1の機能を明らかにすることで、ドパミン過剰下でhyperlocomotionが出現しない原因を明らかにします。これにより、線条体でのドパミンのシグナル伝達経路に対するEP1の作用が明らかになるものと期待しています。

2) EP1のconditional KO mouse作成によるEP1が関与する様々な
   神経機能のそれぞれを担う神経回路の同定

EP1は上に述べたように、ストレスに伴うACTH分泌にも様々なドパミン機能の調節にも関係しています。これら一つ一つのEP1の作用が脳内のどの神経回路に働くことにより発現されているか明らかにするため、現在、EP1のconditional KO mouseを作成中です。作出後は、これを様々な神経経路特異的なCreマウスと掛け合わせることにより、衝動的攻撃性の制御など各々のEP1作用に関係した神経回路の同定を計りたいと考えています。反対に、特異的な神経経路でのEP1の発現を欠失したマウスを用いることにより、その回路でのEP1機能が同定できると期待しています。

3) プロスタノイド受容体各欠損マウスの系統的な行動解析

EP1欠損マウスやEP1遮断薬投与は、上記のような行動異常を示しますが、アスピリン様薬物は一般にこのような行動異常を惹起しません。このことから、脳では、EP1以外のプロスタノイド経路がEP1経路と拮抗するように働いており、これが、EP1経路とバランスをとっていると考えられます。この仮説に則って、EP1を含む各々のプロスタノイド受容体欠損マウスの行動解析を京大先端領域融合医学研究機構の宮川研との共同研究で行っています。これにより、神経系での新しいプロスタノイド作用が、見つかることを期待しています。

3) EP4アゴニストによる潰瘍性大腸炎の医師主導治験

潰瘍性大腸炎は、原因不明の免疫炎症性腸疾患で、患者さんは年余に亘って、下痢、血便、腹痛、瘰痩に悩まされます。患者さんの腸ではPG産生の亢進が認められ、産生量と病気の程度には相関が認められます。また、アスピリンなどCOX 阻害薬の投与は、往々にして炎症性腸疾患の再発、増悪を来たすことから、内因性のPGは本疾患の発症や進展を抑制するのに働いていると考えられています。

そこで、私達は、この抑制作用を外来性のPG受容体作用薬の投与で増強できれば、病気の予防、治療に結びつくと考え、これを目的として、KOマウスを用いこれに働く受容体を同定し、同定した受容体の選択的作用薬の作用を動物実験で解析しました。用いたモデルは、硫酸デキストラン(DSS)投与による腸炎症で、この腸炎症状は、ヒトの潰瘍性大腸炎同様、COX阻害薬投与で悪化しました。そこで、欠損マウスで解析した結果、EP4欠損マウスで腸炎症の増悪を、EP4作動薬で、その改善を認めました(図14)。詳細な解析の結果、EP4は腸管粘膜の再生の促進と腸に浸潤してきたリンパ球の抑制を同時に行い、腸炎症の進展の防止に働いていることを明らかにできました。

図14: 腸組織像
3%DSS投与による腸炎症にて、野生型(左上)と比べEP4欠損マウス(右上)にて、腸炎症の増悪を認めた。野生型の7%DSS投与による腸炎症(左下)に、EP4作動薬を投与することにより、改善を認めた(右下)。

これらの結果を受け、私達は、EP4アゴニストは、実際の潰瘍性大腸炎にも治癒効果があるのではないかと考えました。幸い、用いた薬物ONO-4819・CDは、第1相の治験を終え、別疾患の第2相治験に用いられていましたので、開発者である小野薬品工業株式会社に理解を得、医師主導試験で第2相臨床治験を行っています。

この治験「ONO-4819・CDのサラゾスルファピリジンまたはメサラジン不応性潰瘍性大腸炎を対象とした第II相治験」は、潰瘍性大腸炎の中等症の患者で、サラゾスルファピリジンまたはメサラジン不応性になった方を対象とするもので、京大消化器内科と京大病院探索医療センターと共同で行っているものです。探索医療とか医師主導治験とか巷で大きく喧伝されていますが、立ち上げるには様々な困難があり、決して簡単なものでありません。私達の場合は、共同研究者の努力で、スタートでき、2例目の治験が終了しています。医学部の研究室といっても、普通の場合は、自分たちの考えたことが実際の病気に通用するかを検定することはありませんが、私達は、基礎実験から想起した治療概念の証明を臨床の場ですることまでを一連の薬理実験であると考え行っているものです。