単分子スペックルバイオイメージングプロジェクト

渡邊 直樹

Single-molecule Speckle Bio-imaging Project

Naoki Watanabe

             E-mail: naoki-w@mfour.med.kyoto-u.ac.jp

Figure 1: GFP-actin (green) and Texas red phalloiding staining (red) in spreading XTC fibroblasts (fixed) 細胞伸展縁にアクチン線維に富んだ、発達した葉状突起(lamellipodia)が観察される。


I:研究の背景

 ヒトゲノムの全容が解明されたが、生命科学はそれを超える勢いで発展しつつある。細胞内シグナル伝達研究においても多くの分子機構が見出され、遺伝学的、生化学的な解析を通し、分子間相互作用が明らかになりつつある。

 しかし、生細胞内におけるシグナル伝達の実態については、多くは詳細が不明で、単純な図式に表現される。これは現在の生命科学が、遺伝子の同定や関連した生体の最終的な形質変化の捕捉において卓越するものの、中間にある生体内での過程そのものを観る力が十分でないことに起因している。例えば、Rhoの研究ではそれを特異的にADPリボシル化し、不活化するボツリヌスC3外毒素が用いられるが、C3を微量注入し細胞内のRhoを急速に不活化しても、アクチン生化学における、どの反応がRhoの直接の作用点なのか特定するのは容易ではない。 

 私はこのような困難を克服するため、生細胞内のアクチン重合、脱重合を可視化、定量化する画像化実験法、単分子スペックル法を開発した(Watanabe N. and Mitchison T. J. (2002), Science 295: 1083)。これは蛍光アクチンの生細胞内一分子イメージングを応用している。これを用い、細胞伸展縁におけるアクチン線維の重合、脱重合のキネティクスを高精度に測定することに成功した。実験結果は、細胞伸展縁のアクチンは細胞辺縁からむしろ離れた起点より盛んに重合していること、アクチン線維は重合後すみやか(数秒以内)に脱重合を開始するといったことを明らかにした(Figure 2, 3Movie 1, 2参照 )。

では、この細胞内での早いアクチン線維回転にはどのような意味があるのだろう?

私のグループでは現在、次のような点に注目して細胞運動の原理を探求するとともに、もっともよく解明されているアクチン生化学を基礎に、それを生きた細胞の中での直接の検証を可能とするような新しい科学の樹立に挑んでいます。

I: Background

The human genome is finally decoded, and life science is advancing as vigorously as ever.  Signal transduction research is not an exception.  A number of molecular mechanisms have been found, and their genetic and biochemical interplay are continuously being revealed.

  However, much remains uncertain about what is really going on in living cells.  Our knowledge is often diagramed in a scheme far simpler than in the true in-vivo situation.  This reflects our lack of ability for observing on-going processes in lives, despite the excellence of current science in identifying genes and evaluating the phenotypes related to genetic changes.  For example, to study the small GTPase Rho, we often employ the Botulinum C3 exoenzyme, which specifically ADP-ribosylates and inactivates Rho.  It is, however, not easy to determine the direct acting point of Rho on actin biochemistry even when we rapidly administrate the C3 enzyme into cells using microinjection.

  To overcome such deficiency, I developed the single-molecule speckle method which allowed visualization and quantification of actin polymerization and depolymerization (Watanabe N. and Mitchison T. J. (2002), Science 295: 1083).   This method uses single-molecule imaging of fluorescent actin in live cells.  With this, we were able to measure the actin polymerization-depolymerization kinetics at the leading edge of living cells with high precision.  The data revealed that more actin polymerizes in the body of lamellipodia than at the cell edge, and that actin filaments start depolymerization within seconds after polymerization(See Figure 2-3 and Movie 1-2).

Then, what does this fast actin turnover in cells imply?

My group is now working on the following issues in order to understand the basis of cell migration, and trying to establish a new level of science capable of proving molecular processes directly in live cells with the help of the most advanced biochemistry of actin.

Figure 2: EGFP-actin in a live, spreading XTC cell, and its timelapse movie (Movie1).

Movie 1: EGFP-actin expressed at a high level (conventional GFP-actin movie).  Total time, 10 minutes.  The centripetal flow of the bulk actin network is observable.


Figure 3: EGFP-actin speckles in a live XTC cell, and its timelapse movie (Movie 2).  The expression level of EGFP-actin is hundreds times less than in the cell in Fig. 2.  This low density labeling enables visualization of individual molecules bound to cellular structures.

Movie 2: Single-molecule actin speckle movie.  Total time, 6 minutes.  Individual fluorescent actin copolymerized with cellular filaments is clearly seen.


II:アクチン重合、脱重合経路の謎

 細胞はアクチン重合の力によって細胞辺縁を外に押し出す。 また、速い重合を実現するためにアクチンは絶えず脱重合しなければならない。これらはアクチン重合(伸長)を阻害するサイトカラシンや、脱重合を阻害するジャスプラキノライドが1分以内に細胞辺縁の動きを停止させることからも分かる。

 しかし、試験管内においてもアクチン重合、脱重合の経路は未だ結論が出ていない部分も多い。特に細胞の伸展部にある葉状突起(厚さ200 ナノメーター弱のベール状の構造)では1000マイクロモーラー以上の高濃度のアクチン分子をはじめ、高密度に細胞骨格制御分子が絡んでおり、このような状況が何を生み出すのか、はなはだ興味深いところである。

 単分子スペックル法を発展させ、アクチンのみならず、アクチン関連分子にも応用することで、アクチン重合、脱重合の各経路の貢献度を明らかにし、細胞の伸展機構、運動の制御シグナルのベールをはぐことを試みている。

II: Which way to go? : actin polymerization-depolymerization pathways

Actin polymerization generates force that pushes the cell edge forward.  To ensure fast polymerization, actin filaments do not stay long; depolymerizatioin must be fast too.  These notions are supported by the rapid loss of leading edge dynamics (within 1 minute) upon treatment with cytochalasin, an actin elongation inhibitor, or jasplakinolide, an actin depolymerization inhibitor.

  But even in test tubes with purified components, actin polymerization and depolymerization pathways are not readily determined.  Especially, under the conditions within lamellipodia (a ~200 nm thick veil-like structure at the cell edge) where actin exists at a 1000 micromolar concentration with densely packed regulatory proteins, it is of particular interest to see what such extreme conditions deliver.

  By extending our single-molecule speckle approach not only to actin but also to actin regulatory molecules, we are now trying to clarify how actin polymerization and depolymerization proceed in live cells, and to raise the veil over the signals by which the cell protrusion machinery regulates actin.

III:アクチンレトログレードフロー:retrograde actin flow

 アクチン線維は細胞辺縁において中心に向かって絶えまなく流動していること(retrograde actin flow)が知られている。細胞周辺構造の求心性流動は明視野の顕微鏡観察でも1970年頃より認知されていたが、その意義、制御機構はよく解っていない。細胞辺縁が進展するとき、アクチン線維はその重合によって細胞質膜を前方に押し出す。ところが、アクチン線維は前方への作用とは反対に細胞後方へと流れていくのである。

 現在、この求心性流動はミオシン系の分子に駆動されていると考えられているのと、細胞外基質がアクチンネットワークへの連結が強まるとアクチン流動が遅くなり、結果先端は前に伸展するモデル(クラッチモデル)が神経細胞の成長円錐を用いた観察から提唱されている程度である。

 単分子スペックル法でアクチン重合分布と線維の細胞内移動が観察し、細胞内外の変化がアクチン流動といかに連関するかを調べることで、アクチン流動と強く連関するメカニズムを特定するとともに、細胞伸展の基本機構を解明する。

III: Retrograde actin flow

  The actin network at the cell periphery continuously moves toward the central region (retrograde (backward or centripetal) actin flow).  Although the centripetal movement of cell peripheral structures was recognized from observations using bright field microscopy as long ago as the early 1970s, it is still largely unknown how and why this massive actin flow is generated.  Actin is believed to push the leading edge forward by its polymerization.  However it also moves backward toward the center.

  Presumably the actin flow is, in part, driven by certain members of the myosin family.  Another current theory is the ‘clutch model’ in which the retardation of the actin flow by the strengthened connection of the actin network to the extracellular matrix has been postulated to lead to cell edge protrusion. 

  Now our single-molecule speckle method allows simultaneous measurements of actin polymerization distribution and the actin flow rate change accompanied by cell protrusion.  We hope to identify the mechanisms closely connected with the actin flow and to elucidate the basic nature of the cell protrusion machinery.  

 

IV:細胞内シグナル伝達と細胞骨格改編はどこでつながっているか?

 生細胞内の分子が細胞内構造に結合、解離するダイナミックスを1分子ごとに捉えるイメージング手法、単分子スペックル法をRho のエフェクターであるmDia1GFP融合蛋白質に応用することを試みている。mDia1Rhoの結合で分子内結合が開裂し(Watanabe N. et al. (1999) Nat. Cell Biol. 1: 136)、他のFormin蛋白質の同様にアクチン線維に会合することが予想されるので、Rho-mDia1シグナル伝達をリアルタイムで捉えることができると期待される。

 これまでにmDia1がアクチン細胞骨格に会合し、作用を発揮するイメージを捉えることに成功しつつある。Rho-mDia1シグナルの細胞内時空間特異性を地図化し、アクチン線維のどの改編を直接動かしているのかをイメージングを糸口に解明する。

IV: Bridging the gap between cellular signaling and cytoskeletal reorganization

  We are also trying to apply the single-molecule speckle method to a signaling molecule, namely mDia1, a Rho effector.  Since the intramolecular interaction of mDia1 is disrupted upon the binding of Rho-GTP (Watanabe N. et al. (1999) Nat. Cell Biol. 1: 136), and mDia1 presumably binds actin filaments afterwards as is the case of other Formin-related proteins, we expect to capture on-going Rho-mDia1 signaling.

   Indeed we are capturing images of mDia1 dynamically associating with the cellular actin cytoskeleton and acting on it.  From these new imaging experiments, we hope to both map the spatial and temporal nature of Rho-mDia1 signaling in live cells and visualize the actin reorganizing process conferred by this signaling.